本文目次一覽：

• 1、eve海燕如何配
• 2、對于高爾基的海燕
• 3、EVE菜鳥就教海燕級的艦載各種裝備
• 4、原核體系中影響外源基因表白功率的主要因素？
• 5、廣東產業年夜學研究生導師張海燕如何樣

海燕很蛋疼

他是磁軌炮渠道

而C族年夜局部都是玩導彈的

以是海燕還是比擬合適打撈

要是你非要玩的話

[海燕級, 新的裝置 1 仿造 1]

侵害操控 II

小型護盾回充增量器 II

光子散射式力場 II

熱發散力場 II

中型護盾擴大設置裝備擺設 II

125mm磁軌炮 I, 反物質軌跡彈 S

125mm磁軌炮 I, 反物質軌跡彈 S

125mm磁軌炮 I, 反物質軌跡彈 S

125mm磁軌炮 I, 反物質軌跡彈 S

125mm磁軌炮 I, 反物質軌跡彈 S

125mm磁軌炮 I, 反物質軌跡彈 S

[空的高槽位 ]

[空的高槽位 ]

[空的改裝槽位 ]

[空的改裝槽位 ]

[空的改裝槽位 ]

你太難為我了

對于高爾基的海燕

期間背景：

1901年11月7日那天，尼日尼·諾夫戈羅德的人們很早就把火車站擠滿了，他們是為了給本人喜好的作家高爾基送別。沙皇當局此次破天荒的未經鞠問就急急忙的把高爾基流放到庫爾斯克去。高爾基剛到來，人群中就爆發出了“高爾基萬歲”、“打垮專制軌制”、“打消烏黑氣力”的呼聲。請愿者時而高唱變革歌曲，時而朗讀《海燕》。一位演說者高聲說道：“高爾基被流放了，起因是他說出了真諦并戳穿海燕aaii外呼體系我們日子中可駭的功課。他有一件武器——他的筆，一種力量——他那在自由頒布發表定見時所表明的思想……我們要用請愿來表明我們是如何的喜好高爾基。” 請愿終了后，一位年夜先生沖動的高呼：“暴君即將去世，而巨年夜的無利的自由的百姓即將興起海燕aaii外呼體系！”就因為他的一篇短短的散文詩——《海燕》。

海燕的寫作背景：

高爾基寫這首詩是在1901年俄國榜首次年夜變革的前夕，當時百姓公共的變革靜止風起云涌，沙皇抵拒當局加緊了對百姓的打壓，恰是變革與反變革猛烈斗爭的時候。高爾基當時在彼得堡，親自感到到了工人靜止、先生靜止的彭湃氣魄，目睹了沙皇當局打壓先生靜止的殘暴罪惡。他為了熱心腸歌頌無產階層變革先驅，戳穿沙皇抵拒當局，沖擊機會主義者、資產階層自由派的丑陋嘴臉，就寫下了《海燕》這篇散文詩。

參考材料：

全文與經典句子：

最經典的句子 ——讓狂風雨來得更劇烈些吧

高爾基《海燕》

在蒼茫的年夜海上，狂風卷集著烏云。在烏云和年夜海之間，海燕像玄色的閃電，在高傲的飛翔。

一霎時黨羽碰到波濤，一霎時箭普通地直沖向烏云，它叫喚著，——就在這鳥兒勇敢的叫喚聲里，烏云聽出了歡欣。

在這叫喚聲里——充滿著對狂風雨的渴望！在這叫喚聲里，烏云聽出了仇恨的力量、熱心的火焰和樂成的決計。

海鷗在狂風雨來臨之前太息著，——太息著，它們在年夜海上飛竄，想把本人對狂風雨的惶恐，掩藏到年夜海深處。

海鴨也在太息著，——它們這些海鴨啊，享用不了日子的戰斗的歡欣：霹靂隆的雷聲就把它們嚇壞了。

蠢笨的企鵝，害怕地把瘦弱的身材藏匿到山崖底下……只需那高傲的海燕，勇敢地，自由自由的，在出現白沫的年夜海上飛翔！

烏云越來越暗，越來越低，向海面直壓上去，而波濤一邊歌頌，一邊沖向地面，去迎候那雷聲。

雷聲轟響。波濤在仇恨的飛沫中呼喚，跟狂風爭鳴。看吧，狂風牢牢抱起一層層巨浪，惡狠狠地把它們甩到山崖上，把這些年夜塊的翡翠摔成塵霧和碎末。

海燕叫喚著，飛翔著，像玄色的閃電，箭普通地穿過烏云，黨羽掠起波濤的飛沫。

看吧，它飛翔著，像個精靈，——高傲的、玄色的狂風雨的精靈，——它在年夜笑，它又在叫喚……它笑些烏云，它因為歡欣而叫喚！

這個活絡的精靈，——它從雷聲的震怒里，早就聽出了疲憊，它深信，烏云遮不住太陽，——是的，遮不住的！

狂風吼叫……雷聲轟響……

一堆堆烏云，像青色的火焰，在無底在年夜海上燃燒。年夜海抓住閃電的箭光，把它們停息在本人的深淵里。這些閃電的影子，活像一條條火蛇，在年夜海里蜿蜒游動，一晃就隱沒了。

——狂風雨！狂風雨就要來啦！

這是勇敢的海燕，在吼怒的年夜海上，在閃電核心，高傲的飛翔；這是樂成的先知在叫喚：

——讓狂風雨來得更劇烈些吧

海燕》課時教誨計劃

教誨目標：

1、理解作家及無關背景。

2、在朗讀的基礎上體會著述的深切內涵。

3、理解標記、對比等舉措在文中的使用。

4、培育種植提拔勇敢、剛烈、達不雅、自信的品質和生動的人生立場。

教誨要點：

在朗讀的基礎上體會著述的深切內涵。

教誨難點：

標記舉措的理解。

教誨方法：

朗讀—品味—根究法

教誨歷程：

一、景遇導入（打出海燕圖片，合作熱心音樂）

導語：看，在狂風雨來臨之前，海燕在蒼茫的年夜海上高傲地飛翔，它們被稱為“樂成的預言者”。昔日我們進修散文詩《海燕》，感到高爾基給我們帶來的劇烈的生命之音。（揭題、齊讀）

二、揭示進修目標：（教員理解讀）

1、理解作家及無關背景。

2、在朗讀的基礎上體會著述的深切內涵。

3、理解標記、對比等舉措在文中的使用。

4、培育種植提拔勇敢、剛烈、達不雅、自信的品質和生動的人生立場。

三、作者簡介：

1、 先生相同課外收集的無關作者高爾基的材料。

2、 師生一路清楚作者的主要材料。（幻燈片浮現）。

四、背景引見（幻燈浮現）

請一位先生朗讀背景引見，一路清楚，為更好地理解全文的內涵辦事。

五、朗讀操練：

1、 聽伴奏朗讀，先生可隨著讀，激發先生的朗讀欲望。

2、 自由讀，可能選本人最感樂趣的、最善于的一段或幾段來朗讀。

3、 抽幾位同窗停止階段朗讀比賽（伴奏，提高生動性，營造熱心氛圍。）

4、 點評、夸獎。

六、分解海燕的抽象

導語：經由朗讀，同窗們面前肯定出現了海燕的抽象，假設在海燕之前填上一個潤色語，海燕aaii外呼體系你會填什么呢海燕aaii外呼體系？（先生憑本人的理解，各抒已見，教員應賜與實時的肯定與鼓勵，教員適時板書）（幻燈浮現根究一）。

七、分解本文的寫作舉措：

成績計劃：海燕的精神在文中是如何表現進去的？（根究二）（適時板書）

詳細操縱：1、先生自由回答。教員講到對比舉措時可讓先生朗讀無關描述海鷗等的句子來加以體會，可計劃“海燕的宣言”。

2、標記舉措要作為一個要點詳細幫助先生理解，因為有肯定難度，可思索用連線題。幻燈用超等鏈接的舉措聯合后面的期間背景進一步幫助理解本文的標記意義。

八、朗讀全文（伴奏）

九、課內涵伸（小練筆）

在每團體的日子中，都既有溫暖的愛的陽光照耀，也有百般百般的“狂風雨”檢測。面臨日子的狂風雨，你該如何做呢？就這個話題寫一篇短文。

板書計劃：

對比

襯托

（ ）的海燕 反復

勇敢 高傲 擬人

自信 剛烈 譬喻

充滿斗志 標記

年夜無謂

堅韌不拔

參考材料：根據網絡收集

回答者：hegq - 經理 四級 1-27 13:06

提問者對于謎底的點評：

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對最佳謎底的議論

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議論者： 0o修改帶o0 - 見習邪術師 二級

aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

議論者： BWQ - 助理 三級

上面的更好

議論者： MINGLONGHUA123 - 試用期 一級

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其余回答共 1 條

《海燕》又叫《海燕之歌》，是前蘇聯作家高爾基高爾基1901年3月寫的一篇帶有標記意義的短篇小說春天的旋律的完畢一章。但厥后單獨頒布發表，成為廣為傳抄，極受歡送的出名的散文詩。當時的俄國社會受著沙皇的專制操控，社會烏黑，水深火熱。百姓的變革靜止也越來越低落，高爾基親自目睹了經歷了當時的公共變革靜止，以是聯合當時的變革斗爭場面地步，寫出了《海燕》，用標記的舉措，召喚百姓停止變革斗爭和迎候變革狂風雨的來臨。這首散文詩也深受列寧、斯年夜林的觀賞，被稱為“戰斗的變革詩篇”。

這首散文詩是使用標記舉措獲得巨年夜樂成的范例。標記舉措，類似譬喻，但又不象譬喻那樣開宗明義地“以彼物比此物”，它是經由強化標記體的實質特性，蜿蜒地表現與之類似的人與事，情與理。高爾基說：“在標記上面，可能奇奧地把諷刺和大膽的語言遮蔽起來，在標記中，可能注入很多的思想內容。”在詩中，作者由海燕在狂風雨來臨前象“玄色的閃電”高傲飛翔，標記無產階層變革士兵在變革到來之際的戰斗風味和變革達不雅主義精神；別的，烏云標記沙皇的抵拒操控，年夜海標記廣大公共，海鷗、海鴨、企鵝則標記形形色色的害怕變革的人，狂風雨標記顛覆沙皇抵拒政權的變革靜止。散文詩使用標記舉措，每每是通篇的使用，而不是某個句子的標記意思。在詩中，作者用標記舉措構想全文，把全部組成一幅殘缺的畫面，讓它們分別標記斗爭的場面地步、情況和種種力量，表現了在1905年俄國變革前夕的社會景象，預示了無產階層變革風暴的到來。

這首散文詩另有一個特性即是對比和襯托舉措的奇奧使用。在詩中，為了表現海燕的勇敢、達不雅和對狂風雨的渴望，除了對海燕作間接描述外，還經由狂風雨來臨前夜年夜海海面改變的描述來襯托，并以海鷗、海鴨、企鵝等來作對比。榜首局部寫海鷗、海鴨、企鵝的太息、飛竄、惶恐、藏匿與海燕那高傲的飛翔，歡欣的叫喚組成光鮮明顯的對比，無力地出色了海燕的勇敢、達不雅。第二局部寫波濤與狂風生死斗爭的鏖戰場合排場，恰是以富麗背景來襯托海燕的戰斗雄姿。第三局部寫風、云、雷、電一齊出動，以此背景來襯托海燕那戰斗召喚的奔放高昂，抖擻民氣。

這首散文詩的第三個特點是語言上具備劇烈抒懷性。作為散文詩，《海燕》的句子不分行，但它簡練、抽象、斑斕，有肯定的跳動性，節拍感強。比方“海燕叫喚著、飛翔著，像玄色的閃電，箭普通地穿過烏云，黨羽掠起波濤的飛沫”，短短一句，以“叫喚”寫聲，以“玄色的閃電”寫形，以“飛翔”“穿過烏云”“掠起波濤的飛沫”寫連續串的疾速活絡的活動；有譬喻、有夸張(“箭普通地”，譬喻中兼有夸張)，抽象特性光鮮明顯；較多的句中中斷加強了語言的節拍感，瑯瑯上口。全詩語言充滿熱心，使人抖擻，如完畢“讓狂風雨來得更劇烈些吧!”既是期盼，呼喚變革的風暴，又是對百姓的戰斗召喚。譬喻、夸張、擬人(如“年夜海抓住閃電的箭光，把它們停息在本人的深淵里”)、排比、反復等修辭舉措的使用，使語言斑斕而有氣魄，加強了表白結果。

《海燕》既是一首色調光鮮明顯的抒懷詩，又是一幅賦有音樂的節律和活動感的油畫，具備詩的音樂美和繪畫美，給人很強的藝術感化力。

《海燕》為我們創造了“海燕”的藝術抽象，為無產階層唱出了一曲充滿戰斗熱心的頌歌。

英文版：

On boundless sea, strong winds volume collection dark cloud. Between the dark cloud and the sea, the petrel likes the black the lightning, in arrogant soaring.

A while wing is bumping the wave, a while arrow generally direct impact to the dark cloud, it is yelling, - - on in this bird brave sound, the dark cloud listened to be happy.

Is filling in this sound to the storm hope! In this sound, the dark cloud listened to the angry strength, the warm flame and the victory confidence.

Before the sea gull approaches in the storm is groaning, - - is groaning, they fly on the sea flee, wants oneself to the storm the fear, to hide to the sea deep place.

The auk also is groaning, - - their these auks, could not enjoy the life fight happiness: The bang rumble thunderclap scared them.

The stupid penguin, timidly hides the obese body to the cliff under... ... Only then that arrogant petrel, bravely, free, in exudes the foam on the sea to soar!

Dark cloud more and more dark, is more and more low, straight presses down to the sea level, but one side the wave sings, at the same time fires into the upper air, greets that thunderclap.

Thunderclap thunder. The wave calls in the angry priming, contends with the strong winds. Looks, the strong winds closely hold layer upon layer very rough sea waves, wickedly flings them to the cliff on, falls these bulks jadeites the dust and fog and the powder dust.

The petrel is yelling, is soaring, likes the black the lightning, the arrow passed through the dark cloud generally, the wing plunders the wave the priming.

Looks, it is dancing in the air, likes a demon, - - is arrogant, the black storm demon, - - it is laughing, it also is yelling... ... It smiles a dark cloud, it because of is happy but yells!

This sensitive demon, - - it from thunderclap being furious, already listened to be tired, it deeply believed, the dark cloud could not block from the sun, - - was, could not block from!

The strong winds roar... ... Thunderclap thunder... ...

Pile of dark clouds, like the green the flame, in bottomless burns on the sea. The sea holds the lightning the arrow light, extinguishes them in own abyss. These lightnings shadows, a live image strip fire snake, winds in the sea to hover, as soon as shook vanishes.

Storm! The storm must come!

This is the brave petrel, in roars on sea, among lightning, arrogant soaring; This is the victory prophet is yelling:

Lets the storm come more violent!

破折號：

1） 一霎時黨羽碰到波濤，一霎時箭普通地直沖向烏云，它叫喚著，——就在這鳥兒勇敢的叫喚聲里，烏云聽出了歡欣。

破折號后面的內容寫海燕飛翔的姿態，后邊的內容則寫烏云。從句法上分解，“就在這鳥兒勇敢的叫喚聲里”是一偏正詞組，用來潤色后邊的“烏云聽出了歡欣”。光鮮明顯這兒的破折號表明意思的轉化。

2） 在這叫喚聲里——充滿著對狂風雨的渴望！

在這叫喚聲里，海燕畢竟如何樣，此處沒有描述，以是這兒的破折號表明意思的中斷。

（3） 海鷗在狂風雨來臨之前太息著，——太息著，它們在年夜海上飛竄，想把本人對狂風雨的惶恐，掩藏到年夜海深處。

破折號前后都有“太息著”，表明意思的反復和躍進。

4） 海鴨也在太息著，——它們這些海鴨啊，享用不了日子的戰斗的歡欣：霹靂隆的雷聲就把它們嚇壞了。

由對海鴨的描述轉到對海鴨的議論，破折號表明意思的轉化，一路還起舒緩口吻的結果。

（5） 看吧，它飛翔著，像個精靈，——高傲的、玄色的狂風雨的精靈，——它在年夜笑，它又在叫喚……它笑那些烏云，它因為歡欣而叫喚！

“榜首個破折號表明追加正文，出色海燕的實質特性。第二個破折號表明意思的廷伸和躍進，海燕從‘叫喚’到‘年夜笑’‘叫喚’，更浮現它的變革的達不雅和年夜無畏的氣慨。”（教參）這兒的“追加正文”，實際上即是講解說明。

6） 這個活絡的精靈，——它從雷聲的震怒里，早就聽出了疲憊，它深信，烏云遮不注太陽，——是的，遮不注的！

榜首個破折號表明提醒下文；第二個破折號表明偏重，浮現海燕對變革必勝的決計。

（7）——狂風雨！狂風雨就要來啦！

這是海燕的戰斗的號令，破折號相稱于引號，引人注目。

（8）——讓狂風雨來得更劇烈些吧！

這兒的破折號一方面相稱于引號，另一方面起到總結全文的結果。

海燕所標記的人物：

高爾基寫的《海燕》是一篇有巨年夜影響的散文詩。這篇出名的著述，經由對海燕在狂風雨即將來臨之際勇敢歡欣的抽象描述，深切反應了1905年俄國變革前夜急劇發展的變革場面地步，熱心腸歌頌了俄國無產階層變革先驅者剛烈無畏的戰斗精神，預言沙皇的烏黑操控必將崩潰，預示無產階層變革即將到來并肯定獲得樂成的前景，召喚廣大休息百姓生動活動起來，迎候巨年夜的變革斗爭。因此，它被稱為迎候變革風暴的“戰斗的變革詩篇”。

年夜海波濤標記變革低潮時的廣大百姓公共的力量；狂風雨標記著囊括全部的變革海潮風暴；海燕標記勇敢善戰的無產階層變革的先驅者；海鷗、海鴨、企鵝標記害怕變革會敗壞他們的愉逸窩的形形色色的假變革和不變革者。

以下是EVEwiki里邊間接粘帖過去的。很實在的一句話即是，驅逐艦是一款過渡性的戰艦,很快就可能間接開巡洋艦.尤其是海燕，最出色的個性覺得即是配成打撈船。

艦船裝備實例[修正]小行星帶掃海盜打撈

高槽：1*勁弩火箭發射器I ，1*小型牽引光束 I ,1*打撈器 I,5*200mm輕型偵察員被動加農炮 I

中槽：1*定量型1MN加力燃燒器 I ，3*電容回充器I

低槽：1*反轉平穩器 II

說明：中槽可能把電容回充器換成考古和分解的，本艦船可趁便迷信分解考古才干，其它之以是選射彈炮的長處即是他不費電。

[修正]PVE

高槽：7*125mm磁軌炮

中槽：1*小型能量護盾回充增量器,1*自愿抗盾,1*電容回充器（C族不用配）,1*1MN加力燃燒器

低槽：1*能源確診

船體插件:

說明：這是個需要技術不高的裝備，合適老手用來做一級任務.

驅逐艦是一款過渡性的戰艦,很快就可能間接開巡洋艦.

[修正]PVE

高槽：4*250MM榴彈炮，1*馬庫斯標準導彈發射器，1*平面炸彈，1*打撈，1*牽引

中槽：1*小型能量護盾增量器,2*自愿抗盾,1*1MN加力燃燒器

低槽：1*能源確診

船體插件:無

說明：這個裝備做1級任務。16KM-8KM內的怪底子可能秒殺，比混淆炮的功率高多了，8KM-3KM之間的用導彈處置懲罰，3KM以內的間接用炸彈炸，功率不是普通的高，而且節儉彈藥，一路可能打撈。之以是遴選射彈炮，是因為射彈炮不必耗電，以是電是滿足的。固然，這個僅僅供應個思緒給我們，詳細如何配要看我們的喜歡。

0.4地區裝備

高槽：5*150mm高斯磁軌炮,2打撈掃描儀,1略能

中槽：1*清澈小型能量護盾增量器,1*小擴,1*護盾再生器,1*1MN加力燃燒器

低槽：1*回響反映堆操控

[修正]PVE

新人說本人的裝備：

高槽：150mm磁軌*3，125mm磁軌*2，標導*1，極速炮*2

中槽低槽同上

配好相應炮彈，35KM鎖上了就能打（實在最遠能打40+我按驅逐無加成確認間隔說的），怪飛進20KM內，125炮跟導彈停戰，底子上沖不進10KM內，好不容易出去兩個，極速炮還等著呢，功率很高。這個配法的長處是不管離多遠，都打的省心。缺點是稍微火力貧乏，但是1級任務的怪，也就多兩炮的事。 劇烈倡議新人用驅逐打1級，比保護省心多了，本人試玩的驅逐，就沒任務里爆過。

影響用意基因在年夜腸桿菌中表白的因素？ 瀏覽次數：904次賞格分：0 | 提問時辰：2009-4-28 17:30 | 提問者：lys2126

影響用意基因在年夜腸桿菌中表白的因素？

推薦謎底 ⑴外源基因的復制數

⑵ 外源基因的表白功率

①啟動子的強弱

②核糖體接合位點的有效性

③SD序列和初步密碼ATG的間隔

④密碼子構成

⑶表白產物的平穩性

⑷細胞代謝負荷

⑸工程菌的培育種植提拔條件

計劃構建一個載體，將用意基因在動物根系表白并向根細胞外滲出。請詳細寫出個進程 瀏覽次數：842次賞格分：20 | 處置懲罰時辰：2009-2-14 09:13 | 提問者：370629225

考研的 成績

最佳謎底 先給你貼個器械你先看一下 但愿對你有幫助

將特定的外源基因構建在動物表白載體中并轉入受體動物，并不是動物遺傳轉化的畢竟用意。志向的轉基因動物每每需要外源基因在特定部位和特按時刻內高程度表白，產生人們但愿的表型性狀。然則，近二十年的發展前史卻表明，外源基因在受體動物內每每會出現表白功率低、表白產物不平穩以致基因失活或默然平靜等不良景象，招致轉基因動物無奈投入實際使用。其它，轉基因動物的平安性成績已在很多國度惹起人們的重視，比方，轉基因有大概隨花粉疏散，抗生素遴選標記基因有大概使臨床上的某些抗生素失失結果等等。以上成績的出現使得動物基因工程這一高新技術正處于一種前所未有的困擾期間。針對這些成績，近幾年人們對動物轉基因技術停止了多方面的探索和改進，動物表白載體的改進和優化即是其間最緊張的一項內容，本文就現已獲得的發展停止總述。

1 啟動子的選用和改革

外源基因表白量貧乏每每是得不到志向的轉基因動物的緊張起因。因為啟動子在決定基因表白方面起要害結果，因此，遴選合適的動物啟動子和改進其活性是加強外源基因表白主要要思索的成績。

此刻在動物表白載體中寬泛使用的啟動子是構成型啟動子，比方，絕年夜多數雙子葉轉基因動物均使用CaMV35S啟動子，票據葉轉基因動物主要使用來自玉米的Ubiquitin啟動子和來自水稻的Actinl啟動子。在這些構成型表白啟動子的操控下，外源基因在轉基因動物的所有部位和所有的發育階段城市表白。然則，外源基因在受體動物內持續、高效的表白不但構成摧殘浪費蹂躪，每每還會惹起動物的形態產生改變，影響動物的生長發育。為了使外源基因在動物體內有效闡揚結果，一路又可增添對動物的倒霉影響，此刻人們對特異表白啟動子的研究和使用越來越重視。已發明的特同性啟動子主要包括器官特同性啟動子和誘導特同性啟動子。比方，種子特同性啟動子、果實特同性啟動子、葉肉細胞特同性啟動子、根特同性啟動子、侵害誘導特同性啟動子、化學誘導特同性啟動子、光誘導特同性啟動子、熱激誘導特同性啟動子等。這些特同性啟動子的克隆和使用為在動物中特同性地表白外源基因奠基了基礎。比方，瑞士CIBA-GEIGY公司使用PR-IA啟動子操控轉基因煙草中Bt毒卵白基因的表白，因為該啟動子可受水楊酸及其衍生物誘導，經由噴酒便宜、無公害的化學物質，誘導抗蟲基因在蟲災重產生季節表白，光鮮明顯是一個非常有效的路子。

在動物轉基因研究中，使用人造的啟動子每每不克不及獲得令人滿足的效果，尤其是在停止特異表白和誘導表白時，表白程度年夜多不可志向。對現有啟動子停止改革，構建復合式啟動子將是非常緊張的路子。比方，Ni等人將章魚堿構成酶基因啟動子的轉錄激活區與甘露堿構成酶基因啟動子組成了復合啟動子，GUS表白效果表明：改革后的啟動子活性比35S啟動子光鮮明顯提高。吳瑞等人將操縱誘導型的PI-II基因啟動子與水稻Actinl基因內含子1停止組合，舊式啟動子的表白活性提高了近10倍（專利）。在動物基因工程研究中，這些人工構成的啟動子闡揚了緊張結果。

2 加強翻譯功率

為了加強外源基因的翻譯功率，構建載體時普通要對基因停止潤色，主要思索三方面內容：

2.1減少5‘-3‘-非翻譯序列

很多實驗現已發明，真核基因的5‘-3‘-非翻譯序列（UTR）對基因的失常表白是非常須要的，該區段的缺變態會招致mRNA的平穩性和翻譯程度光鮮明顯降落。比方，在煙草花葉病毒（TMV）的126kDa卵白基因翻譯初步位點下游，有一個由68bp核苷酸構成的Ω元件，這一元件為核糖體供應了新的聯合位點，能使Gus基因的翻譯活性提高數十倍。此刻已有很多載體中外源基因的5‘-端減少了Ω翻譯加強序列。Ingelbrecht等曾對多種基因的 3‘-端序列停止過研究，發明章魚堿構成酶基因的3‘-端序列能使NPTII基因的霎時表白提高20倍以上。其它，差別基因的3‘-端序列增長基因表白的功率有所差別，比方，rbcS3‘-端序列對基因表白的促成結果比查爾酮合酶基因的3‘-端序列高60倍。

2.2 優化初步密碼周邊序列

雖然初步密碼子在生物界是通用的，然則，從差別生物來源的基因各有其特地的初步密碼周邊序列。比方，動物初步密碼子周邊序列的典范特性是AACCAUGC,植物初步密碼子周邊序列為CACCAUG，原核生物的則與二者差別較年夜。Kozak詳細研究過初步密碼子ATG周邊堿基定點驟變后對轉錄和翻譯所構成的影響，并總結出在真核生物中，初步密碼子周邊序列為ACCATGG時轉錄和翻譯功率最高，特地是-3位的A對翻譯功率非常緊張。該序列被前人稱為Kozak序列，并被使用于表白載體的構建中。比方，有一個細菌的幾丁質酶基因，原本的初步密碼周邊序列為UUUAUGG，當被潤色為ACCAUGG，其在煙草中的表白程度提高了8倍。因此，使用非動物來源的基因構建表白載體時，應根據動物初步密碼子周邊序列的特性加以潤色改革。

2.3對基因編碼區加以改革

假設外源基因是來自于原核生物，因為表白機制的差別，這些基因在動物體內每每表白程度很低，比方，來自于蘇云金芽孢桿菌的家養型殺蟲卵白基因在動物中的表白量非常低，研究發明這是因為原核基因與動物基因的差別構成了mRNA平穩性降落。美國Monsanto公司Perlak等人在不改變毒卵白氨基酸序列的條件下，對殺蟲卵白基因停止了改革，選用動物偏疼的密碼子，減少了GC含量，去除原序列下影響mRNA平穩的元件，效果在轉基因植株中毒卵白的表白量減少了30～100倍，獲得了光鮮明顯的抗蟲結果。

3 打消方位效應

當外源基因被移人受體動物中之后，它在差別的轉基因植株中的表白程度每每有很年夜差別。這主要是因為外源基因在受體動物的基因組內刺進位點差別構成的。這即是所謂的"方位效應"。為了打消方位效應，使外源基因都可能整合在動物基因組的轉錄生動區，在此刻的表白載體構建策略中普通會思索到核基質聯合區以及定點整合技術的使用。

核基質聯合區（matrix association region,MAR）是存在于真核細胞染色質中的一段與核基質特異聯合的DNA序列。普通認為，MAR序列坐落轉錄生動的DNA環狀布局哉的邊界，其服從是構成一種切割結果，使每個轉錄單位保持絕對的自力性，免受四周染色質的影響。無關研究表明，將MAR置于用意基因的雙方，構建成包括MAR-gene-MAR布局的動物表白載體，用于遺傳轉化，能光鮮明顯提高用意基因的表白程度，降落差別轉基因植株之間用意基因表白程度的差別，增添方位效應。比方，Allen等人研究了異源MAR（來自酵母）和同源MAR（來自煙草）對Gus基因在煙草中表白的影響，發明酵母的MAR能使轉基因表白水平均勻提高12倍，而煙草本身的MAR能使轉基因的表白水平均勻提高60倍。使用來源于雞溶菌酶基因的MAR也可起到雷同結果。

另一可行的路子是選用定點整合技術，這一技術的主要道理是，當轉化載體含有與寄主染色體同源的DNA片斷時，外源基因可能經由同源重組定點整合于染色體的特定部位。實際操縱時主要要分別染色體轉錄活性地區的DNA片斷，而后構建動物表白載體。在微生物的遺傳操縱中，同源重組定點整合已成為一項老例技術，在植物中外源基因的定點整合已獲得樂成，而在動物中除了葉綠體表白載體可實現定點整合以外，細胞核轉化中還很常見樂成的報導。

4 構建葉綠體表白載體

為了戰敗細胞核轉化中常常出現的外源基因表白功率低，方位效應及因為核基因隨花粉疏散而帶來的不平安性等成績，近幾年出現的一種舊式的遺傳轉化技術--葉綠體轉化，正以它的優勝性和發展前景日益為人們所曉得并遭到重視。到此刻為止，已在煙草、水稻、擬南芥、馬鈴薯和油菜（侯丙凱等，等頒布發表）5蒔植物中接踵實現了葉綠體轉化，使得這一轉化技術初步成為動物基因工程中新的生長點。

因為此刻多蒔植物的葉綠體基因組全序列已被測定，這就為外源基因經由同源重組機擬定點整合進葉綠體基因組奠基了基礎，此刻構建的葉綠體表白載體底子上都歸于定點整合載體。構建葉綠體表白載體底子上都歸于定點案例載體。構建葉綠體表白載體時，普通都在外源基因表白盒的雙方各跟尾一段葉綠體的DNA序列，稱為同源重組片斷或定位片斷（Targeting fragment）。當載體被導入葉綠體后，經由這兩個片斷與葉綠體基因組上的雷同片斷產生同源重組，就大概將外源基因整合到葉綠體基因組的特定位點。在以作物改良為用意的葉綠體轉化中，要求同源重組產生從此，外源基因的刺進既不惹起葉綠體基因原有序列丟失，又不致于敗壞刺進點處原有基因的服從。為滿足這一要求，已有的功課都選用了相鄰的兩個基因作為同源重組片斷，比方rbcL/accD，16StrnV/rpsl2rps7,psbA/trnK,rps7/ndhB。當同源重組產生從此，外源基因定點刺進在兩個相鄰基因的間隔區，確保了原有基因的服從不受影響。比來，Daniel等使用煙草葉綠體基因trnA和trnI作為同源重組片斷，構建了一種通用載體（universal vector）。因為trnA和trnI的DNA序列在高檔動物中是高度留存的，作者認為這種載體可用于多種差別動物的葉綠體轉化。假設這種載體的通用性失去證實，那么這項功課無疑為構建便當而有效的舊式葉綠體表白載體供應了一個好的思緒。

因為葉綠體基因組的高復制性，定點整合進葉綠體基因組的外源基因每每會失去高功率表白，比方McBride等人首次將Bt CryIA(c)毒素基因轉入煙草葉綠體，Bt毒素卵白的表白量高達葉子總卵白的3%～5%，而普通的核轉化技術只能達到0.001%～0.6%。比來，Kota等將Bt Cry2Aa2卵白基因轉入煙草轉入煙草葉綠體，也發明毒卵白在煙草葉子中的表白量很高，占可溶性卵白的2%～3%，比細胞核轉化超出跨越20～30倍，轉基因煙草不僅能抗活絡蟲豸，而且可能百分之百地殺去世那些產生了高抗性的蟲豸。Staub等比來報導，將人的生長激素基因轉入煙草葉綠體，其表白量竟高達葉片總卵白的7%，比細胞核轉化超出跨越300倍。這些實驗充沛說明，葉綠體表白載體的構建和轉化，是實現外源基因高效表白的緊張路子之一。

5 定位旌旗燈號的使用

上述幾種載體優化策略主要用意是提高外源基因的轉錄和翻譯功率，然則，高程度表白的外源卵白可否在動物細胞內平穩存在以及積累量的幾何是動物遺傳轉化中需要思索的另一緊張成績。

近幾年的研究發明，假設某些外源基因跟尾上適當的定位旌旗燈號序列，使外源卵白產生后定向運輸到細胞內的特定部位，比方：葉綠體、內質網、液泡等，則可光鮮明顯提高外源卵白的平穩性和累積量。這是因為內質網等特定地區為某些外源卵白供應了一個絕對平穩的內情況，有效防止了外源卵白的降解。比方，Wong等將擬南芥rbcS亞基的轉運肽序列跟尾于殺蟲卵白基因之前，發明殺蟲卵白可能特同性地積累在轉基因煙草的葉綠體內，外源卵白總的積累量比比較提高了10～20倍。比來，葉梁、宋艷茹等也將rbcS亞基的轉運肽序列跟尾于PHB構成相干基因之前，希圖使基因表白產物在轉基因油菜種子的質體中積累，而后提高外源卵白含量。其它，Wandelt等和Schouten等將內質網定位序列（四肽KDEL的編碼序列）與外源卵白基因相跟尾，發明外源卵白在轉基因動物中的含量有了光鮮明顯提高。光鮮明顯，定位旌旗燈號對于促成卵白質積累有生動結果，但統一種定位旌旗燈號能否合用于所有的卵白另有待于進一步確認。

6 內含子在加強基因表白方面的使用

內含子加強基因表白的結果起頭是由Callis等在轉基因玉米中發明的，玉米乙醇脫氫酶基因（Adhl）的榜首個內含子（intron 1）對外源基因表白有光鮮明顯加強結果，該基因的其余內含子（比方intron8,intron9）也有肯定的加強結果。厥后，Vasil等也發明玉米的果糖構成酶基因的榜首個內含子能使CAT表白程度提高10倍。水稻肌動卵白基因的第三個內含子也能使報導基因的表白程度提高2～6倍。至今對內含子加強基因表白的機制不不分明，但普通認為大概是內含子的存在加強了mRNA的加工功率和mRNA平穩性。Tanaka等人的多項研究表明，內含子對基因表白的加強結果主要產生在票據葉動物，在雙子葉動物中不光鮮明顯。

因為內含子對基因表白有加強結果，Mcelroy等在構建票據葉動物表白載體時，特地將水稻的肌動卵白基因的榜首個內含子保存在該基因啟動子的下賤。雷同，Christensen等在構建載體時將玉米Ubiquitin基因的榜首個內含子置于啟動子下賤，以加強外源基因在票據葉動物中的表白。然則，有研究指出，特定內含子對基因表白的促成結果取決于啟動子強度、細胞范例、用意基因序列等多種因素，以致偶然會取決于內含子在載體上的方位。比方，玉米Adhl基因的內含子9置于Gus基因的5‘端，在CaMV35S啟動子調控下，Gus基因的表白未見加強；當把內含子置于Gus基因3端，在雷同的啟動子操控下，Gus基因的表白程度卻減少了約莫3倍。由此可見，內含子對基因表白的結果機制大概是很混亂的，如何使用內含子構建高效動物表白載體，此刻還貧乏一個牢固的方法，值得進一步會商。

7 多基因策略

迄今為止，多數的遺傳轉化研究都是將繁多的外源基因轉入受體動物。但偶然因為單基因表白強度不可或結果機制繁多，尚不克不及獲得志向的轉基因動物。假設把兩個或兩個以上的能起協同結果的基因一路轉入動物，將會獲得比單基因轉化更為志向的效果。這一策略在培育種植提拔抗病、抗蟲等抗逆性轉基因動物方面已失去使用。比方，根據抗蟲基因的抗蟲譜及結果機制的差別，可遴選兩個服從互補的基因停止載體構建，并經由肯定辦法將兩個抗蟲基因一路轉入一個動物中去。王偉等將外源凝聚素基因和卵白酶按捺劑基因一路轉入棉花，失去了含雙價抗蟲基因的轉化植株。Barton等將Bt殺蟲卵白基因和蝎毒素基因一路轉入煙草，其抗蟲性和防止益蟲產生抗性的才干年夜為提高（專利）。在抗病方面，本實驗室藍海燕等構建了包括β-1，3-葡聚糖酶基因及幾丁質酶基因的雙價動物表白載體，并將其導入油菜和棉花，效果表明，轉基因植株均產生了光鮮明顯的抗病性。比來，馮道榮、李寶健等將2～3個抗真菌病基因和hpt基因連在一個載體上，兩個抗蟲基因與bar基因連在另一個載體上，用基因槍將它們一路導入水稻植株中，效果表明，70%的R。代植株含有導入的全部外源基因（6～7個），且導入的多個外源基因趨勢于整合在基因組的一個或兩個位點。

普通老例的轉化，尚不克不及將年夜于25kb的外源DNA片斷導入動物細胞。而一些服從相干的基因，譬喻動物中的數目性狀基因、抗病基因等，年夜多成"基因簇"的方法存在。假設將某些年夜于100kb的年夜片斷DNA，如動物染色體中人造存在的基因簇或并不相連鎖的一系列外源基因導入動物基因組的統一位點，那么將有大概出現由多基因操控的優良性狀或產生廣譜的抗蟲性、抗病性等，還可能付與受體細胞一種全新的代謝路子，產生新的生物分子。不僅云云，年夜片斷基因群或基因簇的同步刺進還可能在肯定水平上戰敗轉基因帶來的方位效應，增添基因默然平靜等不良景象的產生。比來，美國的Hamilton和我國的劉耀光分別開辟出了新一代載體體系，即具備克隆年夜片斷DNA和借助于農桿菌介導間接將其轉化動物的BIBAC和TAC。這兩種載體不僅可能放慢基因的圖位克隆，而且對于實現多基因操控的種類改良也會有潛伏的使用代價。此刻，對于BIBAC和TAC載體在多基因轉化方面的使用研究還方才初步。

8 遴選標記基因的使用和刪去

遴選標記基因是指在遺傳轉化中可能使轉化細胞（或一般）從許多的非轉化細胞中遴選進去的標記基因。它們普通可能使轉基因細胞產生對某種遴選劑具備抗性的產物，而后使轉基因細胞在減少這種遴選的培育種植提拔基上失常生長，而非轉基因細胞因為貧乏抗性則表現出對此遴選劑的活絡性，不克不及生長、發育和合成。在構建載體時，遴選標記基因跟尾在用意基因一旁，兩者各有本人的基因調控序列（如啟動子、停止子等）。此刻罕用的遴選標記基因主要有兩年夜類：抗生素抗性酶基因和除草劑抗性酶基因。前者可產生對某種抗生素的抗性，后者可產生對除草劑的抗性。使用最多的抗生素抗性酶基因包括NPTII基因（產生新霉素磷酸轉移酶，抗卡那霉素）、HPT基因（產生潮霉素磷酸轉移酶，抗潮霉素）和Gent基因（抗慶年夜霉素）等。罕用的抗除草劑基因包括EPSP基因（產生5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶，抗草甘磷）、GOX基因（產生草甘膦氧化酶、降解草甘膦）、bar基因（產生PPT乙酰轉移酶，抗Bialaphos或glufosinate）等。

下面這些當中1、2、3、5、6都是值得留意的，特地是5，因為你要向細胞外滲出。骨架載體可能遴選PB I121，而后你可能在下面改變基因型。

后邊的即是克隆的進程了，絕對簡單。

1 主要獲得用意基因加酶切位點，連入改好的載體中。

2 將質粒轉入年夜腸桿菌DH5a擴增

3 將擴增好的質粒轉入動物細胞內停止表白

4 收集根細胞外培育種植提拔基檢測能否有該卵白的表白和滲出。

至于改革載體那幾個進程要是答題的話簡單說說就可能了，到底假設真的做出一個好載體都可能本人開公司了。

張海燕傳授

材料能源學院2014-6-16 16:08:24

1.教誨與研究經歷：

1978-1982，中山年夜學半導體物理業余，學士學位。

1995-1998，中山年夜學凝結態物理業余，博士學位。

2007，法國南特年夜學，拜訪學者。

2.研究標的目的：

超等電容器;

鋰離子電池;

染料敏化太陽能電池;

鎳氫電池;

納米復合導熱材料;

納米電磁波吸取和屏障材料;

3.職務、兼職和榮譽稱呼：

廣東產業年夜學傳授、博導；

我國材料研究學會理事，

廣東省材料研究學會副理事長，

廣東省學位委員會學科評斷構成員；

廣東省能源電池及太陽能轉化與儲存材料工程技術研究開辟核心主任；

廣東省教誨廳服從材料的制備與使用技術要點實驗室主任。

4.主持的主要名目：

(1)國度人造迷信基金名目：納米碳-金屬核殼型布局顆粒復合材料的熱傳導個性及其機理研究（51276044），2013.1-2016.12

(2) 國度人造迷信基金名目:依據高導熱，高化學平穩，低密度納米碳熱界面材料的制備及其導熱功用研究(No. 20971027)，2010.1-2012.12

(3) 國度人造迷信基金名目《碳包納米晶的構成、布局與功用研究》 (No.50372013) 2004.1-2006.12

(4)國度人造迷信基金對外相同與合作名目《碳包金屬納米晶導熱材料的研究》 (2006國科金工外資助字第50610105054) 2006.8-2007.8

(5)國度863方案名目：激光舊式加工工藝技術與裝備（2012AA040210）（2012.12-2014.12）(合作)

(6) 國度863方案名目《惡性腫瘤靶向性納米藥物載體及其使用的研究》 (No.2003BA310A24) 2004.1-2006.12 (合作)

(7)國度科技撐持方案課題，疾速檢測技術及電動汽車相干產物和材料檢檢驗證技術研究與演示，2012BAK26B04，2012.10-2014.12(合作)

(8)教誨部高檔黌舍博士學科點專項科研基金《一種全新的磁性靶向藥物載體---碳包鐵納米晶的研究》 (No.20050562002) 2006.1-2007.12

(9)教誨部高檔黌舍博士學科點專項科研基金”高功用納米碳及其復合材料熱傳導舉動的研究” 20094420110005，2010.1-2012.12

(10)廣東省天下合作名目:電磁波材料和東西檢測及使用技術結合研究核心的建立（No.2011B050300017) 2011.10-2013.12

(11)廣東省工程技術研究開辟核心名目:能源電池及太陽能轉化與儲存材料2012B070800015，2012.10-2014.12

(12)廣東省省部產學研企業科技特派員功課站建立名目:廣東信力特種橡膠成品無限公司企業科技特派員功課站(名目編號：2011B090600001)（2011.10-2014.3）

(13)廣東省人造迷信基金要點名目“高功用納米碳及其復合材料熱傳導舉動的研究”（No.9251009001000006) 2010.1-2012.12

(14)廣東省人造迷信基金名目《兼具磁場靶向化療和發燒個性的納米鐵碳復合材料的研究》,（No.07001769) 2008.1-2009.12

(15) 廣東省教誨部產學研聯合名目“ LED照明散熱要害技術的集成開辟及其家產化” （No.2009B090300017）2009.10-2011.12(合作)

(16)廣東省科技方案名目“納米碳材料在染料敏化太陽能電池對電極中的使用技術”(名目編號：2009B011100006) 2009.10-2011.12

(17) 廣東省教誨部產學研合作嚴峻專項“高功用鈦酸鋰儲能電池的要害技術及其家產化” （No.2010A090200063） 2010.12-2013.12(合作)

(18)廣東省高檔黌舍科技創新要點名目：鋰離子能源電池納米復合電極材料的研究， (名目編號：12ZK0088), 2012.1-2014.12

(19) 廣東省高新技術家產開辟區發展疏導專項資金方案名目“高功用磷酸鐵鋰能源電池和高效鈦酸鋰儲能電池研制和家產化” （No.2010A011300041），2011.1-2014.12(合作)

(20)廣州市科技方案名目《高功用取向碳納米管及其復合材料超等電容器的研究》2009.10-2011.12

5.獲獎情況：

1． “碳C60相干材料的研究” 1999年獲廣東省人造迷信獎二等獎（排名第二）

2． “碳納米材料儲氫技術的研究與使用” 2006年獲廣東省迷信技術獎三等獎（排名榜首）

3． “碳納米材料的研究” 2002年獲廣州市迷信技術獎二等獎（排名榜首）

4． “依據年夜功率二次電池用碳納米復合電極的充放電功用研究與使用”2008年獲廣東省迷信技術獎三等獎（排名榜首）

5．“依據年夜功率鎳氫電池用碳納米復合電極的充放電功用研究與使用”2007年獲廣州市迷信技術獎三等獎（排名榜首）

7．“舊式電磁波吸取和屏障材料要害技術的研究與使用"2009年獲廣東省迷信技術獎三等獎（排名榜首）

8．“高功用電磁屏障導電橡膠要害技術的研制及家產化” 2010年獲東莞市迷信技術獎二等獎（排名第二）

9. “高功用導熱橡膠要害技術的研制及家產化”2011年獲東莞市迷信技術獎二等獎（排名第二）